多篇单细胞测序文章助力新型冠状病毒感染、传播机制研究 | 单细胞专题

疫疾无情，人间有爱！自武汉新冠肺炎（Novel coronavirus pneumonia，NCP）疫情发生以来，全国31个省市自治区，共派出百余支医疗队、万余名医护人员奔赴湖北及武汉疫情前线，参与新冠肺炎救治以及防疫工作。除了可爱勇敢的广大医护人员战斗在前线，科技工作者也在争分夺秒地对新冠肺炎病毒进行研究，包括病毒分离鉴定、病毒基因组测序、病毒细胞靶点分析、检测试剂盒开发等，希望尽快从根本上了解这一病毒并寻找战胜它的方法。

单细胞测序能够同时对数万个细胞进行聚类分析，得到每个细胞的基因表达模式，因此利用单细胞测序技术，可以分析病毒靶点在肺部和其他器官的表达分布，这对于了解病毒的感染途径、理解发病机理、设计治疗策略和开展相应的药物治疗具有重要意义。

1血管紧张素转化酶2（ACE2）是2019-nCoV进入细胞需要的受体武汉市肺炎的发生于2019年12月30日首次报告，后来经确定是一种新型冠状病毒(CoV，以下称2019-nCoV)，导致了武汉市肺炎的发生（图1）。图1：2019-nCoV电镜图
为了了解2019-nCoV的起源及其与其他冠状病毒的遗传关系，2020年1月21日中国科学院上海巴斯德研究所研究人员【1】对不同来源的冠状病毒序列进行了系统发育分析，结果表明，2019-nCoV在系统发育树上聚集在一起，属于beta冠状病毒 （Betacoronavirus）属，与之相邻的是SARS或类似SARS的冠状病毒（图2）。图2：武汉新冠病毒系统进化树
血管紧张素转换酶II (ACE2)被认为是SARS-139 CoV14的细胞受体，为了确定ACE2是否也是2019-nCoV的细胞受体，中国科学院武汉病毒研究所研究人员【2】利用来自人类、中华菊头蝠、果子狸、猪和小鼠的表达和不表达ACE2的Hela细胞进行了病毒感染性研究，发现2019-nCoV可以利ACE2作为进入细胞的受体（小鼠除外），这表明ACE2可能是2019-nCoV的细胞受体（图3）。图3：2019-nCoV对ACE2的利用情况
h：人；b：中华菊头蝠；c：果子狸；s：猪; m：小鼠；ACE2蛋白 (绿色)；病毒蛋白(红色) ；细胞核 (蓝色)另外，中国科学院上海巴斯德研究所研究人员还基于计算机指导的同源性建模方法，以SARS冠状病毒S蛋白的晶体结构为模板，通过Swiss-model构建了2019-nCoV S蛋白的结构模型。发现2019-nCoV和SARS-CoV蛋白之间的氨基酸序列同一性为76.47％，根据SARS-CoV S蛋白RBD结构域与其受体ACE2复合结构的晶体结构，通过结构叠加和分子刚性对2019-nCoV S蛋白与人ACE2结合的3D复合结构进行建模（图4）。图4：2019-nCoV S-蛋白与人ACE2结合的预测模型2为什么2019-nCoV更易感染亚裔男性？2020年1月25日，上海同济大学医学院左为教授团队，在预印本网站bioRxiv上发布了一项关于2019-nCoV的文章【3】。研究人员利用在线数据库，对8位正常人肺移植供体的43134个细胞的scRNA-seq数据进行了再分析，基于marker基因表达谱鉴定了8-11个不同的细胞clusters，包括II型肺泡细胞（AT2），I型肺泡细胞（AT1），气道上皮细胞（纤毛细胞和Club细胞），成纤维细胞，内皮细胞和各种类型的免疫细胞。
对每个个体中ACE2的细胞类型特异性表达模式进行分析，发现对于所有供体而言，ACE2在所有人肺细胞中的表达率为0.64%。表达ACE2的细胞中大部分细胞是AT2细胞。平均有1.4±0.4％的AT2细胞表达ACE2。其他表达ACE2的细胞还包括AT1细胞，气道上皮细胞，成纤维细胞，内皮细胞和巨噬细胞。然而，它们表达ACE2的细胞比率较低，且在个体间存在差异（图5）。图5：不同细胞中ACE2表达小提琴图
为了进一步了解这些表达ACE2的细胞，研究人员通过将表达ACE2的AT2细胞与不表达ACE2的AT2细胞进行比较并做了GO富集分析，发现多个病毒过程相关的生物学过程与之存在联系，包括“病毒过程的正向调节”(P=0.001)、“病毒生命周期”(P=0.005)、“病毒组装”(P=0.03)以及“病毒基因组复制的正调节”(P=0.04)。在表达ACE2的AT2细胞中高度表达与病毒过程相关的34个基因，包括SLC1A5，CXADR，CAV2等。因此，2019-nCov似乎已经巧妙地进化到可以劫持AT2这一细胞群体，以进行复制和传播。通过进一步比较供体特征和其ACE2表达模式的联系，发现表达ACE2的细胞数量与供体的年龄或吸烟状况之间未发现关联，但是两个男性供体比其他六个女性供体具有更高的表达ACE2的细胞比例（1.66% VS 0.41%，p=0.07），另外，表达ACE2的细胞分布在男性供体中也比女性更广泛：男性肺中至少有5种不同类型的细胞表达ACE2，而女性肺中只有2-4种细胞表达该受体。需要注意的是，唯一的亚洲捐献者（男性）比白人和非裔美国人捐献者具有更高的表达ACE2的细胞比例（2.50％VS 0.47％）。这可能解释了2019-nCoV流行和以前的SARS流行集中在亚洲地区原因。3消化道可能是2019-nCoV潜在的感染途径与严重急性呼吸系统综合症冠状病毒（SARS-CoV）相同，2019-nCoV通过细胞受体血管紧张素转化酶II（ACE2）进入宿主细胞。为了剖析表达ACE2的细胞组成和比例，并探索2019-nCoV感染在消化系统感染中的潜在途径，2020年1月31日海军军医大学，清华大学及同济大学等多单位研究人员共同开展了相关研究并在bioRxiv在线发表了题为The digestive system is a potential route of 2019-nCov infection: a bioinformatics analysis based on single-cell transcriptomes的研究论文【4】。该研究分析了4个包含肺，食道，胃，回肠和结肠单细胞转录组数据的数据集。分析表明，ACE2不仅在肺AT2细胞，食道上皮和分层上皮细胞中高表达，而且在回肠和结肠的吸收性肠上皮细胞中也高表达。这些结果表明，连同呼吸系统，消化系统也可能是2019-nCov感染的潜在途径。总而言之，这项研究为2019-nCoV在消化系统以及呼吸道中的潜在感染途径提供了生物信息学证据，并且可能对我们预防2019-nCoV感染的健康政策设置有重大影响。
图6：消化道单细胞图谱
4单细胞数据分析揭示潜在易受2019-nCoV侵犯的人类器官源自武汉的新型冠状病毒2019-nCoV 与SARS-CoV相似，通过受体血管紧张素转换酶II（ACE2）侵入人类细胞。在2019-nCoV感染期间，具有ACE2表达的肺细胞可能是病毒的主要靶细胞。但是，除了呼吸道症状外，一些患者还表现出非呼吸道症状，例如肾功能衰竭，这意味着2019-nCoV也可能侵入其他器官。为了构建不同人体器官的风险图，上海交通大学系统生物医学研究院研究团队于2020年2月8日在Frontiers of Medicine 在线发表研究论文：The single-cell RNA-seq data analysis on the receptor ACE2 expression reveals the potential risk of different human organs vulnerable to Wuhan 2019-nCoV infection【5】。该研究分析了来自主要人类生理系统（包括呼吸系统，心血管系统，消化系统和泌尿系统）的单细胞转录组测序（scRNA-seq）数据，不仅确定了诸如肺，心脏，食道，肾脏，膀胱和回肠等器官具有感染风险，而且还可以定位特定的细胞类型，例如II型肺泡细胞（AT2），心肌细胞，肾脏的近端小管细胞，回肠和食道上皮细胞以及膀胱尿路上皮细胞，它们容易受到2019-nCoV感染。基于这些发现，研究人员最终构建了一个风险图（图7），指出了不同器官对武汉新冠病毒感染的脆弱性，为武汉新冠病毒肺炎的预防和治疗提供参考数据和部分理论依据。图7：不同器官武汉新冠病毒感染风险图
5、 2019-nCoV感染后胆管细胞中特定的ACE2表达可能导致肝损伤ACE2是严重急性呼吸综合征冠状病毒（SARS）的宿主细胞受体，已经在介导2019-nCoV感染的实验中得到证明。有趣的是，除呼吸系统外，大量的SARS和2019-nCoV患者还表现出各种程度的肝损害迹象（最近的一项流行病学研究表明，在感染2019-nCoV的99名初始患者中，有43名患者有不同程度的肝功能异常），但其机制和意义尚未确定。2020年2月4日，由上海复旦大学附属中山医院、复旦大学生物医学研究院在bioRxiv杂志上发表研究文章Specific ACE2 Expression in Cholangiocytes May Cause Liver Damage After 2019-nCoV Infection【6】。研究人员使用两个独立队列的单细胞RNA-seq数据对健康肝脏组织中ACE2的细胞类型特异性表达进行了评估，发现胆管细胞和肝细胞中存在特异性ACE2表达，但免疫细胞和基质细胞未见ACE2表达。结果表明，病毒可能直接与ACE2阳性胆管细胞结合，但不一定与肝细胞结合。该发现表明SARS和2019-nCoV患者的肝异常可能不是由于肝细胞损伤引起，而是胆管细胞功能障碍和其他原因，例如药物诱导的和全身性炎症反应引起的肝损伤。研究结果表明，应在住院期间和治愈后不久对2019-nCoV患者进行肝功能异常特别护理。
参考文献1、Evolution of the novel coronavirus from the ongoing Wuhan outbreak and modeling of its spike protein for risk of human transmission2、Discovery of a novel coronavirus associated with the recent pneumonia outbreak in humans and its potential bat origin3、Single-cell RNA expression profiling of ACE2, the putative receptor of Wuhan 2019-nCov4、The digestive system is a potential route of 2019-nCov infection a bioinformatics analysis based on single-cell transcriptomes5、The single-cell RNA-seq data analysis on the receptor ACE2 expression reveals the potential risk of different human organs vulnerable to Wuhan 2019-nCoV infection6、Specific ACE2 Expression in Cholangiocytes May Cause Liver Damage After 2019-nCoV Infection相关阅读2019国自然整体情况 | 单细胞专题之国基金
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